Der Einfluss von Vitamin D auf die Genexpression aktivierter und nicht aktivierter natürlicher Killerzellen : Transkriptomanalyse mittels RNA-Sequenzierung

Abstract

Vitamin D nimmt nicht nur eine wichtige Funktion im Knochenstoffwechsel ein, es spielt darüber hinaus eine bedeutende Rolle bei der angeborenen und adaptiven Immunabwehr 3 und auch bei malignen Neoplasien ist der Vitamin D Serumspiegel der Patienten von prognostischer Relevanz 7, 37. Bei B Zell Lymphomen konnte gezeigt werden, dass ein höherer Vitamin D Spiegel mit einem besseren Überleben assoziiert ist, vor allem wenn die Patienten mit dem monoklonalen Antikörper Rituximab behandelt wurden 6. Die Wirkung monoklonaler Antikörper, die heute in der Tumortherapie routinemäßig eingesetzt werden, ist von der antikörperabhängigen zellvermittelten Zytotoxizität der natürlichen Killerzellen abhängig 60, 75. Basierend auf den Ergebnissen der Ricover 60 Studie konnten Bittenbring et al. bei sieben Probanden nach Supplementation von Vitamin D und Normalisierung des 25 Hydroxyvitamin D-Spiegels eine signifikant höhere antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität nachweisen 6. Für die vorliegende Arbeit wurden zehn Probanden (fünf Frauen und fünf Männer) mit einem Vitamin D-Mangel beziehungsweise einer Vitamin D-Insuffizienz rekrutiert. Nach erfolgter Vitamin D-Supplementation lag der Vitamin D-Serumspiegel aller zehn Probanden im suffizienten Bereich (71,48 ng/ml ± 9,47 ng/ml). Die Aktivität der antikörperabhängigen zellvermittelten Zytotoxizität stieg bei allen Probanden nach Supplementation an, ein signifikanter Anstieg konnte bei acht von zehn Probanden nachgewiesen werden. Es muss folglich angenommen werden, dass die Supplementation von Vitamin D Einfluss auf die Transkription von Genen der natürlichen Killerzellen nimmt, die für die Abwehrfunktion ausschlaggebend sind. Deshalb wurde in dieser Studie die Genexpression an Target-Zellen aktivierter und nicht aktivierter (passiver) natürlicher Killerzellen vor und nach in vivo Vitamin D Supplementation mittels RNA Sequenzierung untersucht. Diese Arbeit konnte sowohl bei passiven als auch bei aktivierten natürlichen Killerzellen nach im Vergleich zu vor in vivo Vitamin D Supplementation Veränderungen im Transkriptom nachweisen, insbesondere aber bei aktivierten natürlichen Killerzellen. Auch bei den zusätzlich durchgeführten Vergleichen aktivierter versus passiver natürlicher Killerzellen jeweils vor und nach Vitamin D Supplementation zeigten sich zahlreiche Gene differentiell exprimiert. Wobei bei diesen beiden Vergleichen viele der hoch- und runterregulierten Gene unabhängig vom Vitamin D Status übereinstimmen und somit auf die Aktivierung der natürlichen Killerzellen zurückzuführen sind. 2.440 Gene wiesen jedoch eine signifikante Änderung der Expression nach Aktivierung der natürlichen Killerzellen nur nach Vitamin D Supplementation auf, diese Gene könnten von besonderem Interesse sein. Da nicht einzelne differenziell exprimierte Gene die Funktion einer Zelle ausmachen, sondern das Zusammenspiel vieler Transkripte, die sich innerhalb einer Zelle unter verschiedenen Bedingungen zu biologischen Pfaden (engl. Pathways) organisieren, erfolgte zudem eine Genmengen Anreicherungsanalyse. Damit konnte nachgewiesen werden, dass zentrale Pfade der Immunabwehr und der Signaltransduktion bei den verschiedenen Vergleichen angereichert werden. Hervorzuheben ist, dass sowohl bei passiven als auch bei aktivierten natürlichen Killerzellen nach Vitamin D Supplementation der “Cytokine-cytokine receptor interaction“ Pathway signifikant stärker exprimiert wird. Dieser Pathway ist entscheidend für die intrazelluläre Regulation von Zellen, die an der angeborenen und der adaptiven Immunabwehr beteiligt sind 17. Bereits bei peripheren mononukleären Zellen konnte eine Anreicherung des “Cytokine-cytokine receptor interaction“ Pathways nach ex vivo Vitamin D Supplementation nachgewiesen werden 24. Darüber hinaus konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass der Pathway “natural killer cell mediated cytotoxicity“ bei passiven und aktivierten natürlichen Killerzellen nach Vitamin D Supplementation angereichert wird. Dieser biologische Pfad beinhaltet sowohl die Kaskaden der aktivierenden und inhibierenden Rezeptoren von natürlichen Killerzellen im Allgemeinen, als auch die der antikörperabhängigen zellvermittelten Zytotoxizität im Speziellen 47.

Vitamin D not only plays an important role in bone metabolism, but is also crucial for the innate and adaptive immune system 3. Furthermore, a patient's vitamin D serum level is of prognostic relevance in cancer 7, 37. In B-cell lymphomas, it has been shown that a higher vitamin D level is associated with better survival, especially when patients were treated with the monoclonal antibody rituximab 6. The effect of monoclonal antibodies, which nowadays are routinely used in tumor therapy, is dependent on the antibody-dependent cellular cytotoxicity of the natural killer cells 60, 75. Based on the results of the Ricover-60 study, Bittenbring et al. were able to demonstrate a significantly higher antibody-dependent cellular cytotoxicity after supplementation of vitamin D and normalization of the 25-hydroxyvitamin D level in seven patients 6. For the present work, ten volunteers (five women and five men) with a vitamin D deficiency or vitamin D insufficiency were recruited. After supplementation, the vitamin D serum levels of all participants were measured in the sufficient range (71.48 ng/ml ± 9.47 ng/ml). Antibody-dependent cellular cytotoxicity increased in all study participants after supplementation; a significant increase was detected in eight out of ten volunteers. It must therefore be assumed that vitamin D supplementation influences the transcription of the genes of natural killer cells that are important for defense function. Thus, in this study we investigate the gene expression of natural killer cells, that were activated on target cells (activated natural killer cells) or not activated (passive natural killer cells), before and after in vivo vitamin D supplementation using RNA sequencing. We were able to detect changes in the transcriptome of passive and activated natural killer cells after compared to before in vivo vitamin D supplementation, but especially in activated NK cells. In the additional comparisons of activated versus passive natural killer cells before and after vitamin D supplementation, numerous genes were found to be expressed differentially. In these two comparisons, many of the up- and down-regulated genes match regardless of vitamin D status and can therefore be attributed to the activation of natural killer cells. However, a total of 2.440 genes showed a significant change in expression after natural killer cell activation only after vitamin D supplementation. These genes may be of particular interest. Not individual differentially expressed genes determine the function of a cell, but rather the interaction of many transcripts organizing themselves into biological pathways within a cell under different conditions. For this reason, we conducted a gene set enrichment analysis (GSEA). Using GSEA, it was demonstrated that central pathways of immune defense and signaling were enriched in the various comparisons. It should be highlighted that the “cytokine-cytokine receptor interaction” pathway is significantly more expressed in both passive and activated natural killer cells after vitamin D supplementation. This pathway is important for the intracellular regulation of cells involved in the innate and adaptive immune system 17. An enrichment of the “cytokine-cytokine receptor interaction” pathway after ex vivo vitamin D supplementation has already been demonstrated in peripheral mononuclear cells 24. Furthermore, this study showed that the “natural killer cell mediated cytotoxicity” pathway is enriched in passive and activated natural killer cells after vitamin D supplementation. This biological pathway includes both the cascades of activating and inhibiting receptors of natural killer cells in general, as well as those of antibody-dependent cellular cytotoxicity in particular 47.