A Sperm microRNA Panel for Assessing Male Subfertility and Predicting Assisted Reproductive Outcomes

Abstract

Sperm quality, which is primarily determined by morphology, motility, and concentration, is crucial to male fertility and has a significant impact on the results of assisted reproductive technologies (ART). Even while regular semen analysis is still a common clinical method, it is not always able to identify underlying molecular issues that might jeopardize fertilization or the development of the embryo. The increasing volume of research indicates that sperm-borne microRNAs (miRNAs) represent important components of spermatogenesis and sperm function, and their changed expression may provide more information than conventional metrics. The purpose of this research was to employ quantitative reverse transcription PCR (RT- qPCR) to assess the potential use of certain sperm miRNAs as biomarkers in an ART environment and to determine if they are linked to semen quality, embryo development, and pregnancy outcomes. There were 85 male partners in this validation investigation who were part of couples receiving fertility therapy. A variety of semen quality and spermatogenic impairment were represented in the purified sperm samples, which were processed in accordance with World Health Organization (WHO) criteria. Using RT-qPCR, we measured specific miRNAs and investigated the relationship between their expression and biochemical pregnancy, live birth outcomes, hormonal indicators, semen characteristics, and embryo morphology. Higher sperm concentration, progressive motility, and normal morphology are characteristics of higher-quality semen, which have been repeatedly linked to better embryo development. Poorer embryo grades were more prevalent as semen quality decreased, while couples with top-grade embryos (Grade 1) often had samples with exceptional sperm motility and morphology. This trend is consistent with reports that sperm characteristics affect embryo survival and fertilization competency, even in techniques like intracytoplasmic sperm injection (ICSI) that omit certain functional stages. The findings of RT-qPCR indicated that three miRNAs, including hsa-miR-15b- 5p, hsa-miR-19a-5p, and hsa-miR-20a-5p, were especially informative. Lower sperm concentration, a larger percentage of immotile sperm, and decreased sperm motility and morphology were all substantially correlated with increased expression of these miRNAs. These miRNA levels corresponded with a number of clinical indicators: reduced expression was found in instances that led to successful clinical pregnancies and live births, while higher expression was observed in samples associated with lower β-hCG levels or worse pregnancy outcomes. The pattern of embryonic development was comparable. Sperm samples connected to G1 embryos often had lower expression levels of these miRNAs, while samples linked to G2 (Grade 2) embryos typically had greater expression levels. This implies that early development may be impacted by sperm with dysregulated miRNA expression. With area under the curve (AUC) values ranging from 0.71 to 0.76, each miRNA demonstrated modest diagnostic accuracy for IVF outcomes when evaluated for predictive significance. An AUC of 0.75 was obtained by a combined model that included all three miRNAs, suggesting that they may together provide significant insights into the probability of treatment effectiveness. All things considered, our results support the concept that sperm miRNAs may identify aspects of sperm activity that are not discernible from traditional semen analysis alone. The three discovered miRNAs (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-19a-5p, and hsa-miR-20a-5p) clearly correlate with embryo development and pregnancy outcomes and appeared to represent underlying spermatogenic or functional abnormalities. Therefore, measuring them might be useful for determining male fertility or planning ART therapy. This research concludes that some sperm miRNAs detected by RT-qPCR might be helpful indicators of the quality of semen and its potential for reproduction. Higher levels of hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-19a-5p, and hsa-miR-20a-5p were associated with lower embryo quality, poorer semen parameters, and a lower likelihood of pregnancy and live birth. MiRNA analysis may enhance the capacity to detect mild male-factor infertility and improve ART prognosis when included in current diagnostic processes

Die Qualität der Spermien, insbesondere hinsichtlich Konzentration, Motilität und Morphologie, spielt eine entscheidende Rolle für die männliche Fertilität und beeinflusst maßgeblich den Erfolg assistierter Reproduktionstechniken (ART). Die routinemäßige Samenanalyse liefert zwar grundlegende diagnostische Informationen, erfasst jedoch nicht immer molekulare Störungen, die die Befruchtung oder die frühe Embryonalentwicklung beeinträchtigen können. In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass spermiengetragene Mikro-RNAs (miRNAs) wichtige Hinweise auf den Zustand der Spermatogenese und die Funktionalität der Spermien geben können. Veränderungen ihrer Expression könnten zusätzliche Informationen über die männliche Fertilität liefern, die über klassische Samenparameter hinausgehen. Ziel dieser Arbeit war es daher, zu untersuchen, ob bestimmte miRNAs in Spermien mit Samenqualität, Embryonalentwicklung und Schwangerschaftsverlauf assoziiert sind, und zu prüfen, ob sie sich als Biomarker im ART-Kontext eignen. Die Analyse erfolgte mittels quantitativer RT-PCR (RT-qPCR). In die Validierungsstudie wurden 85 männliche Partner von Paaren eingeschlossen, die sich einer Fruchtbarkeitsbehandlung unterzogen. Die Spermien wurden gemäß WHO-Richtlinien aufgereinigt und deckten ein breites Spektrum an Samenqualitäten ab. Anschließend wurde die Expression ausgewählter miRNAs mittels RT-qPCR bestimmt und in Beziehung zu Samenparametern, Hormonprofilen, Embryoqualität, biochemischer Schwangerschaft und Lebendgeburten gesetzt. Wie erwartet zeigte sich, dass eine höhere Samenqualität – insbesondere höhere Konzentration, bessere progressive Motilität und ein größerer Anteil normal geformter Spermien – eng mit einer besseren Embryoqualität verknüpft war. Top-Embryonen (G1) stammten überwiegend aus Proben mit höherer Motilität und Morphologie, während schwächer entwickelte Embryonen häufiger mit eingeschränkten Samenparametern verbunden waren. Diese Beobachtungen decken sich mit bekannten Zusammenhängen zwischen Spermieneigenschaften und Befruchtungs- bzw. Entwicklungsfähigkeit, selbst bei Verfahren wie Intracytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI), die einige funktionelle Hürden umgehen. Die RT-qPCR-Analysen zeigten, dass drei miRNAs – hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-19a-5p und hsa-miR-20a-5p – besonders aussagekräftig waren. Eine erhöhte Expression dieser miRNAs war deutlich mit reduzierter Motilität, schlechterer Morphologie, niedrigeren Spermienkonzentrationen und einem höheren Anteil unbeweglicher Spermien verbunden. Darüber hinaus spiegelten sich diese miRNA-Profile auch in klinischen Markern wider: hohe miRNA-Werte traten vermehrt bei Proben auf, die zu erniedrigten β-hCG-Werten oder ausbleibenden Schwangerschaften führten, während niedrige Expressionswerte bei erfolgreichen Behandlungen und Lebendgeburten vorkamen. Auch die Embryoentwicklung zeigte klare Zusammenhänge. Spermienproben, die zur Entstehung von G1-Embryonen führten, wiesen in der Regel niedrigere Expressionsniveaus der drei miRNAs auf. Höhere Werte hingegen fanden sich häufiger bei Proben, die zu G2-Embryonen führten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Fehlregulationen dieser miRNAs bereits frühe Entwicklungsprozesse beeinflussen könnten. Bei der Bewertung ihres diagnostischen Potenzials zeigten die drei miRNAs jeweils eine moderate Vorhersagekraft für IVF-Ergebnisse, mit AUC-Werten zwischen 0,71 und 0,76. Ein kombiniertes Modell erreichte eine AUC von 0,75 und erwies sich damit als vielversprechend für eine mögliche klinische Anwendung. Zusammengefasst sprechen die Ergebnisse dafür, dass spermiengetragene miRNAs wertvolle zusätzliche Informationen über die männliche Fruchtbarkeit liefern können, die in der klassischen Samenanalyse nicht sichtbar werden. Die identifizierten miRNAs – insbesondere hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-19a-5p und hsa-miR-20a-5p scheinen Ausdruck zugrunde liegender funktioneller Einschränkungen zu sein und stehen in engem Zusammenhang mit Embryoqualität, Schwangerschaftsraten und Lebendgeburten. Eine Ergänzung der bestehenden Diagnostik durch die Analyse solcher miRNAs könnte helfen, subtile Störungen der Spermatogenese früher zu erkennen und die Prognose bei ART-Behandlungen präziser einzuschätzen. Insgesamt zeigt diese Arbeit, dass die Bestimmung ausgewählter miRNAs mittels RT-qPCR ein nützliches Werkzeug zur Bewertung der männlichen Fertilität darstellt. Erhöhte Spiegel der drei untersuchten miRNAs waren mit schlechteren Samenparametern, ungünstiger Embryoentwicklung und niedrigeren Erfolgsraten verbunden. Niedrigere Expression hingegen ging mit besseren reproduktiven Ergebnissen einher. Eine Integration miRNA-basierter Marker in die klinische Routine könnte dazu beitragen, Diagnostik und Behandlungsplanung bei Paaren mit unerfülltem Kinderwunsch weiter zu verbessern.