Immunhistochemische Expression des Kationenkanals TRPC6 in der Unterkiefer- und Tränendrüse und in Speicheldrüsentumoren

Abstract

Hintergrund: Dass Ca2+-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Proliferation von Krebszellen spielen, haben Studien der letzten drei Jahrzehnte gezeigt. Kanonische Transient Receptor Potential (TRPC)-Kanäle, die für Ca2+ permeabel sind, werden als zellmembranständige, nicht-selektive Kationenkanäle in vielen Gewebetypen exprimiert und sind an der Proliferation von Krebszellen beteiligt. Die Bedeutung des TRPC6-Subtyps in der Tumorentstehung wurde bisher unter anderem beim Prostatakarzinom, Mammakarzinom, Ösophaguskarzinom, Nierenzellkarzinom, Leberzellkarzinom, Glioblastom, kleinzelligen Lungenkarzinom und Gebärmutterhalskarzinom nachgewiesen. Das Vorkommen von TRPC6 in der Glandula submandibularis sowie die Bedeutung einiger TRPC-Kanäle (TRPC1 und TRPC3) in dieser Drüse wurden bisher am Tiermodell nachgewiesen. Bis jetzt gibt es nur wenige Daten über den Nachweis von TRPC6 in menschlichem Gewebe, insbesondere in menschlichem Tränen- und Unterkieferdrüsengewebe. Auch das Vorkommen von TRPC6 in Speicheldrüsentumoren ist kaum untersucht. Die Erforschung von TRPC6 erfolgt nämlich hauptsächlich an Tiermodellen. Die Untersuchung dieses Kanals am Menschen könnte zu neuen Therapien, mit TRPC6 als Zielmolekül, führen. Eine Grundlage für die Entwicklung neuer Medikamente ist ein besseres Verständnis der physiologischen und pathophysiologischen Bedeutung sowie der Lokalisierung von TRPC6 in menschlichem Drüsengewebe, insbesondere der Tränen- und Unterkieferdrüse sowie in Tumoren der Unterkieferdrüse. Während der TRPC6-Kanal im Tierversuch und auch beim Menschen auf mRNA-Ebene nachgewiesen wurde, sind bisher keine systematischen Untersuchungen zum Nachweis des TRPC6-Proteins in der menschlichen Tränen- und Unterkieferdrüse sowie in Tumoren der Unterkieferdrüse bekannt. Das Hauptziel dieser Forschungsarbeit war der immunhistochemische Nachweis der Expression des TRPC6-Kanals in humanen Proben von physiologischen Tränen- und Unterkieferdrüsen sowie in Tumorproben von adenoid-zystischen Karzinomen und Mukoepidermoidkarzinomen. Eine systematische Analyse unter Berücksichtigung von Struktur, Geschlecht, Karzinomtyp und Gewebequalität wurde angestrebt.

Methode: Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden sieben (n=7) fixierte Körper-spender untersucht, die von der Prosektur des Anatomischen Instituts der Medizini-schen Fakultät der Universität des Saarlandes zur Verfügung gestellt wurden. Die Entnahme der zehn (n=10) Gewebeproben erfolgte eigenständig unter Verwendung von Pinzetten und Skalpell aus der Glandula submandibularis und der Glandula lacrimalis. Die gewonnenen Proben wurden anschließend in mehreren Arbeitsschritten zu histologischen Schnittpräparaten verarbeitet und zunächst mit Hämatoxylin-Eosin angefärbt. Zusätzlich wurden in dieser Studie sechs (n=6) Tumorpatienten einbezogen. Die sechs (n=6) Tumorproben wurden bereits als Tumorschnitte auf dem Objektträger von dem Pathologischen Institut und von der Klinik für Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde des Uni-verstitätsklinikum des Saarlandes, zur Verfügung gestellt. Die Bestimmung des Nach-weises von TRPC6 in dem untersuchten Gewebe erfolgte mittels Immunhistochemie. Die immunhistochemische Färbung der ausgewählten Gewebeproben wurde durch indirekte Detektion mit einem primären TRPC6-Antikörper, einem sekundären HRP-konjugierten Antikörper und dem Chromogen Diaminobenzidin durchgeführt.

Ergebnisse: Der Nachweis von TRPC6 in allen (n=10) physiologischen Proben der Glandulae submandibulares und Glandulae lacrimales mittels immunohistochemische Analyse konnte somit bewiesen werden: Sie zeigten alle ein positives immunhistochemisches Signal, wenn auch mit unterschiedlicher Intensität. Es konnten keine wesentlichen geschlechtsspezifischen Unterschiede in Bezug auf die IHC festgestellt werden. Dazu konnte der Nachweis von TRPC6 in vier (n=4) von sechs Proben von malignen Veränderungen der Glandula submandibularis, wie dem ACC und dem MEC, mittels Immunohistochemie bestätigt werden. Die Ausführungsgänge wiesen in jedem Gewebe, in dem sie gefunden wurden, TRPC6 auf. Das Tumorgewebe, insbesondere das Zytoplasma und die Zellkerne der Tumorzellen, wiesen ebenfalls TRPC6 auf, sowohl in ACC als auch in MEC. Die mukösen Tubuli und ihre Zellkerne zeigten im Allgemeinen kein Signal, ebenso die Zellkerne der Fettzellen. Die restlichen Strukturen (seröse Azini und ihre Zellkerne) zeigten ein schwaches Signal für TRPC6.

Schlussfolgerung: Mit dieser Arbeit konnte der Nachweis von TRPC6 in menschlichem exokrinen Drüsengewebe der Unterkiefer- und Tränendrüse sowie im Tumorgewebe der Unterkieferdrüse, des adenoid-zystischen Karzinoms und des Mukoepidermoidkarzinoms gezeigt werden. Die Erkenntnis über das Vorhandensein der Kanäle im Drüsengewebe gibt nun die Gelegenheit, die bislang ungeklärte Rolle dieser Kationen-kanäle z.B in der Speicheldrüsenfunktion, d.h. in der Bildung des Speichels, weiter auf-zuklären. Zusätzlich sollten weitere Speicheldrüsen auf TRPC6-Expression untersucht werden. Es ist nicht auszuschließen, dass es aufgrund seiner grundlegenden Funktion an der Regulation der zellulären Calcium-Homöostase beteiligt sein könnte. Auch die funktionelle Bedeutung des nicht-selektiven Kanals in der Glandula lacrimalis und ihre Erkrankungen müssen noch geklärt werden. Darüber hinaus liefert die Entdeckung der Kanäle in diesen Tumoren somit die Grundlage, um die bis heute unbekannte Bedeutung dieser Kationenkanäle für die Tumorentstehung in ACC und MEC näher zu erforschen. So könnte TRPC6 als Angriffspunkt für Medikamente in der Therapie von diesen Tumoren dienen, die bereits in anderen Geweben zum therapeutischen Einsatz kommen. Welche Zusammenhänge zwischen TRPC6 und den Erkrankungen der Glandula submandibularis und Glandula lacrimalis tatsächlich bestehen, ist noch nicht hinreichend geklärt. Weitere wissenschaftliche Arbeiten sind zu diesem Zweck notwendig.

Background: Calcium channels play a crucial role in the proliferation of cancer cells, as studies over the last three decades have shown. Canonical transient receptor poten-tial (TRPC) channels, which are permeable to Ca2+, are expressed as cell membrane-bound, non-selective cation channels in many tissue types and are involved in the pro-liferation of cancer cells. The importance of the TRPC6 subtype in carcinogenesis has so far been demonstrated in prostate carcinoma, breast carcinoma, oesophageal carcinoma, renal cell carcinoma, hepatocellular carcinoma, glioblastoma, small cell lung carcinoma and cervical carcinoma, among others. The presence of TRPC6 in the submandibular gland and the importance of some TRPC channels (TRPC1 and TRPC3) in this gland have so far been demonstrated in animal models. To date, there is limited evidence of TRPC6 in human tissues, especially in human lacrimal and submandibular gland tissue. The presence of TRPC6 in salivary gland tumors has also been hardly investigated. Research of TRPC6 is mainly carried out on animal models. The investigation of this channel in humans could lead to new therapeutic approaches using TRPC6 as a target molecule. A prerequisite for the development of new drugs is a better understanding of the physio-logical and pathophysiological significance and localization of TRPC6 in human glandular tissue, particularly in the lacrimal and mandibular glands and in tumors of the mandibular gland. While the TRPC6 channel has been detected at the mRNA level in both animal experiments and in humans, no systematic studies on the detection of the TRPC6 protein in the human lacrimal and submandibular gland and in tumors of the submandibular gland are known to date. The main objective of this research was the immunohistochemical detection of TRPC6 channel expression in human samples of physiological lacrimal and submandibular glands and in tumor samples of adenoid cystic carcinoma and mucoepidermoid carcinoma of the submandibular gland. A systematic analysis considering structure, gender, carcinoma type and tissue quality was aimed at.

Method: In the present study, seven (n=7) fixed body donors were examined, which were provided by the Prosecture of the Anatomical Institute of the Medical Faculty of Saarland University. The ten (n=10) tissue samples were taken autonomously from the submandibular and lacrimal gland using forceps and a scalpel. The collected samples were then processed in several steps into histological slides and first stained with Hematoxylin-Eosin. In addition, six (n=6) tumor patients were included in this study. The six (n=6) tumor samples were already provided as tumor slides by the Institute of Pathology and the Department of Otorhinolaryngology of the Saarland University Hospital. The detection of TRPC6 in the examined tissue was determined by immunohistochemistry. The immunohistochemical staining of the selected tissue samples was performed by indirect detection with a primary TRPC6 antibody, a secondary HRP-conjugated antibody and the chromogen diaminobenzidine.

Results: The detection of TRPC6 in all (n=10) physiological samples of the glandulae submandibulares and glandulae lacrimales by immunohistochemical analysis was there-fore proven: all samples showed a positive immunohistochemical signal, although with different intensity. No significant gender-specific differences could be detected regarding IHC. In addition, the detection of TRPC6 in four (n=4) of six samples of malignant changes of the submandibular gland, such as the ACC and the MEC, could be con-firmed by immunohistochemistry. The excretory ducts showed TRPC6 in every tissue in which they were found. The tumor tissue, especially the cytoplasm and nuclei of the tumor cells, also showed TRPC6 in both ACC and MEC. The mucous tubules and their nuclei generally showed no signal, as did the nuclei of the fat cells. The remaining structures (serous acini and their nuclei) showed a weak signal for TRPC6. Conclusion: This study provides evidence for the presence of TRPC6 in human exocrine gland tissue of the submandibular and lacrimal glands as well as in tumor tissue of the submandibular gland, adenoid cystic carcinoma and mucoepidermoid carcinoma. The knowledge about the presence of these channels in glandular tissue now provides the opportunity to further clarify the previously unexplained role of these cation channels, e.g. in salivary gland function, i.e. in the formation of saliva. In addition, further salivary glands should be examined for TRPC6 expression. It cannot be ruled out that it could be involved in the regulation of cellular calcium homeostasis due to its fundamental function. The functional significance of the non-selective channel in the lacrimal gland and its diseases also remains to be clarified. Furthermore, the discovery of the channels in these tumors provides the groundwork for further research into the as yet unknown significance of these cation channels for tumor development in ACC and MEC. TRPC6 could therefore be used as a target for drugs in the treatment of these tumors which are already being used therapeutically in other tissues. However, the actual correlation between TRPC6 and diseases of the submandibular gland and lacrimal gland has not yet been fully established. Further scientific work is required in this regard.