Die Rolle von hepatischen Cholesterinkristallen und des NLRP3-Inflammasoms in transgenen Abcg5/g8 Mäusen.

Abstract

Die nicht-alkoholische Fettleber ist eine Erkrankung, die aktuell eine steigende Prävalenz zeigt und in der Zukunft eine wachsende Bedeutung haben wird. Aufgrund der Assoziation zum metabolischen Syndrom und dessen kardiovaskulären Komplikationen ist die Erkrankung mit einer hohen Mortalitätsrate verbunden. Bisher werden für die Ätiologie neben diätischen und genetischen Aspekten eine Vielzahl an Faktoren verantwortlich gemacht, welche eine Dysbalance der Lipidhomöostase auslösen. Insbesondere werden genetischen Varianten im Cholesterinstoffwechsel eine besondere Bedeutung zugeschrieben. Hier hat der ABCG5/G8-Transporter, welcher an der apikalen Membran von Enterozyten und Hepatozyten lokalisiert ist, eine hohe Relevanz. ABCG5/G8 sezerniert Sterole und ist aufgrund häufiger genetischer Polymorphismen, welche mit der Bildung von Gallensteinen assoziiert sind, klinisch besonders relevant. Ziel dieser Arbeit war es, das Verständnis des ABCG5/G8-Transporters zu erweitern und zu untersuchen, welche Rolle dieser Transporter in der Pathophysiologie des Lipidstoffwechsels der Leber einnimmt. Dafür wurden zwei durch Cre-loxP Rekombinationen in Mäusen generierte gewebsspezifische Knock-Out Linien verwendet, bei welchen der Transporter entweder im Darm oder in der Leber ausgeschaltet wurde. Bei einer weiteren Mauslinie wurde der Einzelnukleotidpolymorphismus p.D19H, der beim Menschen mit Gallensteinen assoziiert ist, mittels BAC-Rekombination in das Abcg8-Gen integriert. Weiterhin wurden die Tiere in zwei Fütterungsgruppen eingeteilt, wobei eine Gruppe eine Standardfütterung und die andere eine fett- und cholesterinreiche Diät erhielt. Histologische Leberpräparate wurden mit Hämatoxylin-Eosin zur Übersicht, weitere mit Oil red O zur Darstellung von Neutralfetten gefärbt und zusätzlich konnten Cholesterinkristalle in nativen Schnitte unter polarisiertem Licht sichtbar gemacht werden. Genexpressionsanalysen des NLRP3-Inflammasoms und des Effektorzytokins Interleukin-1β sollten Aufschluss über eine cholesterinkristallinduzierte Entzündungsreaktion geben. Um den Einfluss der Transportermodifikationen auf den Lipidstoffwechsel zu charakterisieren, wurden weitere Genexpressionsanalysen von regulatorischen Proteinen und Enzymen sowie eine Lipidomanalyse durchgeführt. Die Ergebnisse der Arbeit zeigten, dass die beiden gewebsspezifischen Knock-Out Linien zu einer Fettleber neigen. Diese Steatose ist durch eine Triacylglycerid- und Cholesterinakkumulation sowie eine beginnende Cholesterinkristallisation gekennzeichnet. Die Lipidom- und Genexpressionsanalyse ergaben, dass die Triacylglyceridsteatose nicht auf eine gesteigerte De-novo-Lipogenese, sondern möglicherweise auf ein gestörtes Lipidremodeling zurückzuführen ist. Die lithogene Diät führte zum histologischen Bild einer nicht-alkoholischen Steatohepatitis, zusätzlich wurden solide Cholesterinkristalle im Lebergewebe detektiert. In Zusammenschau mit Genexpressionsanalysen konnte nachgewiesen werden, dass die Cholesterinkristallbildung mit einer erhöhten Nlrp3- sowie Il-1β Expression und folglich einer Entzündungsreaktion der Leber assoziiert war. Die Analysen ergaben weiterhin, dass der Knock-Out des Transporters entweder im Darm oder der Leber ausreicht, um die Veränderungen hervorzurufen. Die bisher postulierte Transporterüberfunktion durch den p.D19HPolymorphismus des Abcg8-Gens konnte in dieser Arbeit nicht bestätigt werden. Die Daten deuten eher auf eine Unterfunktion hin, da sich dieser Phänotyp wie eine milde Form des Knock-Outs präsentiert. Aufgrund eines Mangels an zugelassenen medikamentösen Therapien hat die Identifizierung von Risikopatienten einen hohen Stellenwert. Patienten mit genetischen Varianten, die zu einer ABCG5/G8- Unterfunktion führen, sollte zu präventiven Maßnahmen wie sportlicher Betätigung und einer fett- und insbesondere cholesterinarmen Diät geraten werden. Pharmakologische Angriffspunkte bieten mit Ezetimib oder Statinen Cholesterinresorption und -synthese. Insgesamt kann dem ABCG5/8- Transporter eine protektive Rolle in der NAFLD-Entwicklung zugeschrieben werden, sodass der Knock-Out ein neues Mausmodell für die Fettleberkrankung darstellt.

Non-alcoholic fatty liver is a disease that is currently showing an increasing prevalence and is expected to become even more important in the future. As it is associated with metabolic syndrome and cardiovascular complications, the disease reaches a high mortality rate. To date, in addition to dietary and genetic aspects, a variety of factors relating to the imbalance of lipid homeostasis are understood to be part of the aetiology. Particular importance is attributed to cholesterol metabolism due to genetic causes. Here, the ABCG5/G8 transporter, which is localised at the apical membrane of enterocytes and hepatocytes, plays an important role. ABCG5/G8 secretes sterols and became clinically relevant due to genetic polymorphisms associated with the formation of gallstones. The aim of this work was to expand the knowledge about the ABCG5/G8 transporter to better understand its role in the pathophysiology of liver diseases. To this end, two tissue-specific knock-out lines were generated by Cre-loxP recombinations in mice, in which the transporter was deleted either in the intestine or in the liver. In a third mouse line, the single nucleotide polymorphism p.D19H, which is associated with increased risk of gallstone disease in humans, was integrated by BAC recombination in the Abcg8 gene. Furthermore, animals were divided into different feeding groups, one receiving a standard chow and the other a lithogenic diet. A portion of the histological liver sections were stained with haematoxylin-eosin for overview, others with Oil red O to detect neutral lipids, and additional native sections were viewed under polarised light to visualise cholesterol crystals. Gene expression analyses of the NLRP3 inflammasome and the effector cytokine Interleukin-1β should provide insight into a cholesterol crystal-induced inflammatory response. To characterise the influence of the transporter modifications on lipid metabolism, further gene expression analyses of regulatory proteins and enzymes as well as a lipidome analysis were performed. The results of the work showed that the two tissue-specific knock-out lines tended to develop fatty liver. This steatosis is characterised by an accumulation of triacylglycerides and cholesterol as well as by incipient cholesterol crystallization. Lipidome and gene expression analyses further revealed that triacylglyceride steatosis was not due to an increase in de novo lipogenesis but possibly to impaired lipid remodeling. The lithogenic diet resulted in histological defined non-alcoholic steatohepatitis; in addition, solid cholesterol crystals were detected in liver tissue. In combination with gene expression analyses it could be shown that cholesterol crystal formation was associated with increased Nlrp3 and Il-1β expression and consequently with an inflammatory reaction of the liver. The analyses also demonstrated that the transporter knock-out in either the intestine or the liver is sufficient to induce the changes. The previously postulated transporter gain-of-function due to the p.D19H polymorphism of the Abcg8 gene could not be confirmed in this work. The data rather suggests a loss-of-function, as this phenotype presents like a weaker form of knock-out. Due to a lack of approved therapeutic options, the identification of patients at risk of developing nonalcoholic fatty liver is of high importance. Patients with genetic polymorphisms leading to ABCG5/G8 hypofunction should be advised to take preventive measures such as exercise and a low-fat and especially low-cholesterol diet. Regarding drug interventions, cholesterol absorption and synthesis provide pharmacological targets for ezetimibe or statins. Overall, a protective role in NAFLD development can be attributed to the ABCG5/8 transporter and knock-out can continue to serve as a mouse model of fatty liver disease.